目的和原理 水中細(xì)菌總數(shù)往往同水體受有機(jī)物污染的程度呈正相關(guān)，它是評(píng)價(jià)水質(zhì)污染程度的一個(gè)重要指標(biāo)之一。由于重金屬及某些其它有毒物質(zhì)對(duì)細(xì)菌有殺滅或抑制作用，因此總細(xì)菌數(shù)少的水樣，并不能排除已被這些物質(zhì)所污染。

　　本試驗(yàn)采用標(biāo)準(zhǔn)平皿法對(duì)水樣中細(xì)菌作計(jì)數(shù)，這是一種測(cè)定水中好氧的和兼性厭氧的異養(yǎng)細(xì)菌密度的方法，由于細(xì)菌在水體中能以單獨(dú)個(gè)體、成對(duì)、鏈狀，成簇或成團(tuán)的形式存在，此外沒(méi)有單獨(dú)的一種培養(yǎng)基或某一環(huán)境條件能滿足一個(gè)水樣中所有細(xì)菌的生理要求，所以由此法所得的菌落數(shù)實(shí)際上要低于被測(cè)水樣中真正存在的活細(xì)菌的數(shù)目。細(xì)期總數(shù)是指1毫升水樣在營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中，37℃、24小時(shí)培養(yǎng)后所生長(zhǎng)的菌落數(shù)。一般規(guī)定，1毫升自來(lái)水中總菌數(shù)不得超過(guò) 100個(gè)。 9.4.1.2 材料和器皿 (1)培養(yǎng)基

　?、贍I(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基

　?、?216E培養(yǎng)基：蛋白胨 5.0克; 酵母膏 1.0克; FePO4 0.01克; 瓊脂 18.0克; 陳海水 1000毫升; pH 7.6～7.8

　　(2)無(wú)菌采樣瓶、滅菌移液管、滅菌培養(yǎng)皿，盛有90ml及 9mL滅菌蒸餾水的錐形瓶和試管。 方法和步驟 (1)采集水樣。

　　(2)吸取10 ml水樣(河水、污水、游泳池水或港灣水等)，注進(jìn)盛有90ml無(wú)菌水或無(wú)菌海水的三角瓶中，混勻成10-1稀釋液，在吸水樣前，水樣應(yīng)徹底攪動(dòng)均勻。

　　(3)按10倍稀釋法將水樣稀釋成10-2、10-3、10-4。

　　(4)根據(jù)水樣的潔凈程度，污染嚴(yán)重者選取10-2、10-3、10-4稀釋度;中等的選取10-1、10-2、10-3稀釋度，每個(gè)稀釋液分別注進(jìn)兩個(gè)培養(yǎng)皿，每皿 1ml。稀釋度的選擇是本試驗(yàn)精確度的關(guān)鍵，選擇適宜者，平皿上菌落總數(shù)介于30—300個(gè)之間。

　　(5)注進(jìn)徹底融化，然后冷卻到45℃的營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(用于河水樣)或2216E培養(yǎng)基(用于海水、港灣水樣)約15ml，立即旋搖培養(yǎng)血，充分混勻，水平放置至固化。

　　(6)接種河水的培養(yǎng)皿，顛倒于37℃培養(yǎng)24小時(shí)。接種海水樣，港灣水樣的培養(yǎng)皿，應(yīng)顛倒后于18—20℃下培養(yǎng)到長(zhǎng)出明顯菌落(5天左右)止。 結(jié)果與分析 取同一稀釋度的平板培養(yǎng)物，依菌落計(jì)算原則進(jìn)行計(jì)算。

　　(1)菌落計(jì)算原則

　　平皿菌落的計(jì)算，可用肉眼觀察，必要時(shí)用放大鏡檢查，防止遺漏，也可借助于菌落計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)。對(duì)長(zhǎng)得相當(dāng)接近，但不相觸的菌落，應(yīng)予以—一計(jì)數(shù)。對(duì)鏈狀菌落，應(yīng)當(dāng)作為一個(gè)菌落來(lái)計(jì)算。平皿中若有較大片狀菌落時(shí)則不宜采用，若片狀菌落少于平皿的一半時(shí)，而另一半中菌落分布又均勻，則可將其菌落數(shù)的2倍作為全皿的數(shù)目。算出同一稀釋度的均勻菌數(shù)，供下一步計(jì)算時(shí)用。

　　(2)計(jì)算方法

　?、偈紫冗x擇均勻菌落數(shù)在30～300者進(jìn)行計(jì)算。當(dāng)只有一個(gè)稀釋度的均勻菌落數(shù)符合此范圍時(shí)，即可用它作為均勻值乘其稀釋倍數(shù)(見(jiàn)表5-9的例1)。

　　②若有兩個(gè)稀釋度的均勻菌落數(shù)都在30—300之間，則應(yīng)按兩者的比值來(lái)決定。若其比例小于2，應(yīng)報(bào)告兩者的均勻數(shù);若大于2，則報(bào)告其中較小的數(shù)字(見(jiàn)表7-例2和例3)。

　?、奂偃缢邢♂尪鹊木鶆蚓鋽?shù)均大于300，則應(yīng)按稀釋度最高的均勻菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報(bào)告之(見(jiàn)表5-9例4)

　　④若所有稀釋度的均勻菌落數(shù)均小于30，則應(yīng)按稀釋度最低的均勻菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報(bào)告之(見(jiàn)表5-9例5)。

　　⑤假如全部稀釋度的均勻菌落數(shù)均不在30—300之間，則以最接近300或30的均勻菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報(bào)告之(見(jiàn)表5-9例6)。

　?、劬溆?jì)數(shù)的報(bào)告，菌落在100以內(nèi)時(shí)，按實(shí)有數(shù)報(bào)告;大于100時(shí)，采用二位有效數(shù)字，在二位有效數(shù)字后面的數(shù)值，以四舍五進(jìn)方法計(jì)算，為了縮短數(shù)字后面的零數(shù)也可用10的指數(shù)來(lái)表示(見(jiàn)表5-9的“報(bào)告方式”欄)。

　　表5-9 稀釋度選擇及菌落報(bào)告方式

　　例次

　　不同稀釋度的均勻菌落數(shù)

　　兩個(gè)稀釋度菌落數(shù)之比

　　菌落總數(shù)(個(gè)/ml)

　　報(bào)告方式(個(gè)/ml)

　　10 -1

　　10 -2

　　10-3

　　1

　　1360

　　164

　　20

　　-

　　16400

　　16000或1.6×104

　　2

　　2760

　　295

　　46

　　1.6

　　37750

　　38000或3.8×104

　　3

　　2890

　　271

　　60

　　2.2

　　27100

　　27000或7×104

　　4

　　無(wú)法計(jì)數(shù)

　　4651

　　513

　　-

　　513000

　　510000或5.1×105

　　5

　　27

　　11

　　5

　　-

　　270

　　270或2.7×102

　　6

　　無(wú)法計(jì)數(shù)

　　305

　　12

　　-

　　30500

　　31000或3.1×104

　　水中大腸菌群(Coliform group)細(xì)菌的檢測(cè)

　　目的和原理 假如水源被糞便污染，則有可能也被腸道病原菌污染而引起腸道傳染病。由于腸道病原菌在水中數(shù)目較少，故從水中特別是自來(lái)水中分離病原菌經(jīng)常非常困難。大腸菌群細(xì)菌是腸道好氧菌中最普遍和數(shù)目最多的一類細(xì)菌，所以經(jīng)常將其作為糞便污染的指示菌。即根據(jù)水中大腸菌群細(xì)菌的數(shù)目來(lái)判定水源是否受糞便所污染，并間接推測(cè)水源受腸道病原菌污染的可能性。一般規(guī)定每1000ml自來(lái)水中大腸菌群細(xì)菌不得超過(guò)3個(gè)。

　　大腸菌群細(xì)菌是指一類好氧或兼性厭氧，能發(fā)酵乳糖，在乳糖培養(yǎng)基中經(jīng)37℃ 24小時(shí)培養(yǎng)，能產(chǎn)酸產(chǎn)氣，革蘭氏陰性，無(wú)芽孢的桿菌。

　　本試驗(yàn)采用多管發(fā)酵法，以最近似數(shù)的方式來(lái)記載，此一數(shù)字是根據(jù)概率公式來(lái)估算，有大于實(shí)際數(shù)字的傾向，在增加每種稀釋度的試管重復(fù)數(shù)后，可減少偏差。本法除了用于檢測(cè)水樣(淡水或海水)外，尚可用于泥漿、沉積物、污泥等的檢測(cè)。測(cè)定時(shí)先將這類固體或半固體樣品預(yù)先稱重，再加水稀釋，可取50克樣品，置于盛有450ml滅菌磷酸鹽緩沖液并裝有玻璃珠、石英砂的錐形瓶中，振蕩1—2分鐘，便成10-1稀釋，以用于檢驗(yàn)。 材料與器皿 (1)培養(yǎng)基

　　二倍濃度的乳糖膽汁液體培養(yǎng)基

　　一倍濃度的乳糖膽汁液體培養(yǎng)基

　　伊紅——美藍(lán)瓊脂(E.M.B.)培養(yǎng)基

　　亮綠乳糖膽汁(B.G.B)液體培養(yǎng)基

　　營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基

　　(2)滅菌移液管、滅菌稀釋水、試管、杜漢氏小管、革蘭氏染液、滅菌培養(yǎng)皿 方法與步驟 (1)假定試驗(yàn)

　　①用10ml水樣，接種到二倍濃度的乳精膽汁管中往，重復(fù)接三支 。

　?、谟胠ml水樣，接種到一倍濃度的乳精膽汁管中往，重復(fù)接種三支。

　?、壑苽渌畼?10-1和 10-2的稀釋液。

　　④分別接種lml10-1和 10-2稀釋液到一倍濃度的乳糖膽汁管中，每個(gè)稀釋液接種三支。

　　⑤在35℃中培養(yǎng)48小時(shí)，觀察有無(wú)氣體和酸產(chǎn)生。

　?、拊?8小時(shí)以內(nèi)，培養(yǎng)管內(nèi)顛倒的杜漢氏管中有任何量的氣體積累，便可斷定為陽(yáng)性假定試驗(yàn)。若培養(yǎng)管內(nèi)液體清楚而杜氏管中有氣泡時(shí)，可能為放置不當(dāng)而殘存的空氣泡，不可與產(chǎn)氣的陽(yáng)性反應(yīng)相混同。無(wú)氣泡著為陰性。產(chǎn)酸者呈黃色。

　　(2) 確信試驗(yàn)

　?、偃〕赎?yáng)性和陽(yáng)性可疑的初步發(fā)酵試管，輕輕振蕩或轉(zhuǎn)動(dòng)，然后以無(wú)菌的金屬接種環(huán)，轉(zhuǎn)移1環(huán)培養(yǎng)物至亮綠乳糖膽汁管中，于35C℃培養(yǎng)48小時(shí)。如在顛倒的杜漢氏管中產(chǎn)氣，不論其量多寡，皆為陽(yáng)性確信試驗(yàn)。

　?、诜渤醪桨l(fā)酵試驗(yàn)管在24小時(shí)之前就顯示活躍的發(fā)酵(產(chǎn)氣量占杜漢氏管10%以上)的試管，應(yīng)及時(shí)轉(zhuǎn)移至確信試驗(yàn)的培養(yǎng)基。

　　(3)完成試驗(yàn)

　?、偃∩鲜鲫?yáng)性確信試驗(yàn)管，在伊紅一美藍(lán)平板上劃線分離，為了確保獲得分離的單菌落，須留意以下事項(xiàng)：a.劃線間距至少相隔0.5厘米; b.接種針尖端要稍彎曲;c.先對(duì)發(fā)酵管輕擊，并使之傾斜，以免接種針挑取到任何膜狀物或浮渣，d.劃線時(shí)要用針尖的彎曲部分接觸瓊脂培養(yǎng)基平面，以免刮傷或戳破培養(yǎng)基。劃線后培養(yǎng)皿顛倒，于35C培養(yǎng)24小時(shí)。

　?、? 24小時(shí)后，觀察在EMB平板上出現(xiàn)的單個(gè)菌落，具核心及深綠色金屬光澤者為較典型的大腸菌群菌落。盡可能挑取典型的或接近典型的大腸菌群菌落，在營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面上劃線，置37 ℃培養(yǎng)24小時(shí)。挑取斜面培養(yǎng)物制成涂片，進(jìn)行革蘭氏染色，凡屬革蘭氏陰性桿菌，即確認(rèn)了大腸菌群細(xì)菌的存在。

　?、?在EMB平板上呈較典型的大腸菌群細(xì)菌還可再次轉(zhuǎn)接至乳糖膽汁發(fā)酵管中，在37℃下培養(yǎng)48小時(shí)，產(chǎn)生氣體者即確認(rèn)了大腸菌群細(xì)菌的存在。

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